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食品單增李斯特菌的特異性檢測

更新時間:2019-07-24  |  點擊率:1307

李斯特菌為革蘭氏陽性菌,包含有6種,但只有單核細(xì)胞增生李斯特菌導(dǎo)致人類疾?。ň哂懈咧滤缆剩?,而伊氏李斯特菌只與其他哺乳動物疾病相關(guān)。

 

單核細(xì)胞增生李斯特菌已在食品、環(huán)境和臨床樣本中被發(fā)現(xiàn)。其檢測方法為培養(yǎng)法,在我國食品安全國標(biāo)中有詳細(xì)的描述。該方法靈敏度高,堪稱為金標(biāo)準(zhǔn)。從樣本收集開始,對于陰性結(jié)果的得出,通常需要3-4天,陽性結(jié)果通常需要5-7天。對于食品企業(yè),則希望檢測結(jié)果能更快出來。

 

食品單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測,受到如下這幾個因素的影響:即競爭菌群的干擾、目標(biāo)菌滴度較低,以及食品成分所帶來的抑制和干擾。因此,以抗體和分子手段為基礎(chǔ)的方法也開發(fā)出來,大部分具有同等的靈敏度,但更快,同時在48h內(nèi)能完成檢測。

 

然而,在選擇方法時要注意,大部分檢測方法無法區(qū)分不同的李斯特菌物種。在不同的李斯特菌物種中,只有單增李斯特菌是人類的病原菌,因此需要采用物種特異的方法。同時,也應(yīng)注意,并不是所有的單增李斯特菌菌株都導(dǎo)致人類疾病。在13種單增李斯特菌的血清型中,只有3種即1/2a,1/2b和4b導(dǎo)致90%以上的人類病例。

 

表1.實驗室鑒別單增李斯特菌的主要試驗

物種

溶血反應(yīng)

磷脂酰肌醇磷脂酶C

鼠李糖發(fā)酵

木糖發(fā)酵

單增李斯特菌

+

+

+

-

伊氏李斯特菌

+

+

-

+

斯氏李斯特菌

+

-

-

+

英諾克李斯特菌

-

-

V

-

威氏李斯特菌

-

-

V

+

格氏李斯特菌

-

-

V

-

 

在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中,步是增菌。增菌的作用是提高分離的靈敏度,使得25g食品樣品中即使有1個李斯特菌也能被檢測出來。該增菌過程是選擇性的,即抑制無關(guān)菌群生長。其選擇因子包括吖啶黃(抑制革蘭氏陽性菌生長)、萘啶酸(抑制革蘭氏陰性菌)和一種真核生物蛋白抑制劑,用于抑制真菌生長。其他抗生素包括頭孢他啶和拉氧頭孢和氯化鋰。李斯特菌分離培養(yǎng)基有的還有七葉苷,因為李斯特菌屬具有使七葉苷水解的特征反應(yīng)。

 

顯色培養(yǎng)基提供了一種簡便的分離鑒定李斯特菌和單增李斯特菌的方法。它主要根據(jù)李斯特菌所含有的特異酶以及特定的糖發(fā)酵反應(yīng)來進(jìn)行的。通過采用李斯特菌顯色培養(yǎng)基,單增李斯特菌有可能在24h后得到初步鑒定,而之前的Oxford培養(yǎng)基等傳統(tǒng)型培養(yǎng)法則需要3-4天。顯色培養(yǎng)基也適合大部分的食品類型。

 

毒力基因plcA,在單增李斯特、伊氏李斯特和斯氏李斯特菌中均存在,它編碼磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPL-C),它常用于鑒別溶血性李斯特菌和非溶血性李斯特菌。L--磷脂酰肌醇(PI)被PIPL-C裂解產(chǎn)生不溶于水的脂肪酸,在溶血性李斯特菌菌落周圍形成不透明的白色暈環(huán)。它和β-D-葡萄糖苷酶一起,構(gòu)成了ALOA李斯特菌分離顯色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)(下圖)。在該培養(yǎng)基中,只有單增與伊氏李斯特菌有白色暈環(huán)。

 

 

圖. HiMedia公司生產(chǎn)的李斯特菌顯色培養(yǎng)基(ALOA法)(貨號MV1540)

 

可疑菌落應(yīng)進(jìn)行鑒定,如革蘭氏陽性染色,無芽孢桿菌,過氧化氫酶陽性,氧化酶陰性,28℃存在動力,37℃不存在動力。

 

生化鑒定試劑盒可進(jìn)一步鑒定李斯特菌的物種。HiMedia提供了2款李斯特菌物種生化鑒定試劑盒(貨號分別為KB012A,KBM003A,下圖)。鑒定卡上包含了12個迷你生化反應(yīng),囊括了經(jīng)典的生化鑒定試驗。KBM003A多出動力學(xué)鑒定試驗。

 

HiMedia公司生產(chǎn)的HiBio-ID菌種生化鑒定試劑盒

 

致病李斯特菌和非致病李斯特菌可通過它們的溶血反應(yīng)或PIPL-C活性來鑒別。溶血反應(yīng)是鑒別單增李斯特(溶血)和英諾克李斯特菌(不溶血)的常用試驗。PIPL-C活性則可通過顯色培養(yǎng)基檢測。木糖和鼠李糖發(fā)酵則可將單增李斯特與伊氏李斯特和斯氏李斯特區(qū)分開來,單增是木糖(—)鼠李糖(+),伊氏和斯氏是木糖(+)鼠李糖(-)。丙氨酸肽酶是所有李斯特物種具有、單增李斯特菌不具有的一種酶,也可用于物種鑒別。

 

對于其他檢測方法,為保證靈敏度,仍然需要增菌。免疫法檢測閾限較高,而核酸擴增法更為靈敏,但PCR反應(yīng)容易被食品中的成分所抑制,并且不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。增菌可以稀釋那些抑制成分,并且使檢測的核酸是來自生長的細(xì)胞。核酸法的特異性更強,并且速度也較快,并以qPCR定性為主。

 

在采用新檢測方法之前,有必要對方法進(jìn)行驗證。在上,ISO和AOAC的標(biāo)準(zhǔn)可以參考。

 

HiMedia公司是微生物產(chǎn)品生產(chǎn)商,一直致力于微生物培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基的研發(fā)和生產(chǎn),其顯色培養(yǎng)基有80多種,涵蓋各個領(lǐng)域,包括無動物源成分及化學(xué)限定的,并具有WHO GMP認(rèn)證、ISO9001:2008,ISO13485:2003認(rèn)證,CE認(rèn)證和FDA注冊登記。其產(chǎn)品行銷140多個國家。

 

締一生物作為HiMedia公司在中國的代理商,在微生物培養(yǎng)和檢測領(lǐng)域,一如既往地為您帶來的服務(wù)。

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