目前新guan病毒在疫苗研發(fā)和基礎(chǔ)領(lǐng)域獲得了更大的關(guān)注。許多新guan病毒的檢測都針對(duì)的是ORF1ab和N基因或E基因，但本文介紹的是新guan病毒的另一個(gè)靶點(diǎn)RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），用于病毒的檢測，它不用于診斷，只用于研究。

一、新guan病毒RT-qPCR引物/探針（套裝）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它包括3個(gè)成分：

①橙蓋： 2019-nCoV Mix（凍干粉），1管。

此管為新guan病毒引物/探針，可特異性擴(kuò)增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會(huì)被檢測到【1】【2】。（該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實(shí)驗(yàn)室公布的新guan病毒引物/探針序列而設(shè)計(jì)【1】。

如要檢測其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號(hào)：271-1100。

②綠蓋： Positive Control RNA（陽性對(duì)照RNA，凍干粉），1管。

此陽性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。

③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。

二、使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級(jí)水（③白蓋）復(fù)溶，并分裝，避免反復(fù)凍融。

該引物/探針應(yīng)與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應(yīng)檢測。

三、檢測樣本需為抽提過的RNA樣本。

四、新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴(kuò)增的人RNA酶P基因（過程對(duì)照）用ROX™通道檢測，用以評(píng)估樣本的制備質(zhì)量。

五、該方法有三處特別的地方：

1. 靶點(diǎn)特別。依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見的ORF1ab和N基因或E基因。

2.陽性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。

3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，性能穩(wěn)定。

4. 適用于科研中，各種來源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌等。

六、操作注意事項(xiàng)：

該引物/探針應(yīng)僅由經(jīng)過培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員使用。

始終穿上合適的防護(hù)fu和戴一次性手套。

根據(jù)樣品類型，應(yīng)謹(jǐn)慎處理所有樣品。請(qǐng)遵循WHO推薦的方法處理樣本。

該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

七、操作步驟：

步驟1. 試劑制備

①橙蓋2019-nCoV Mix引物探針凍干粉，大速離心5秒鐘，加入525μl PCR級(jí)水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

②綠蓋Positive Control RNA陽性對(duì)照凍干粉，大速離心5秒鐘，加入105μl PCR級(jí)水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl 反應(yīng)體積）

（1）1個(gè)反應(yīng)需要加入：酶預(yù)混液 （自備的紅蓋預(yù)混液）10μl ，

橙蓋（復(fù)溶的2019-nCoV Mix引物/探針）5μl 

（紅蓋預(yù)混液 來自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】（RT-qPCR法），

英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號(hào)192-0025/-0100/-0250，需單獨(dú)購買）

（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

（3）每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對(duì)照，或5μl PCR級(jí)水作為無模板對(duì)照，或5μl陽性對(duì)照RNA。

（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。

步驟3. 設(shè)置qPCR程序

1個(gè)循環(huán)： 55 ℃，10分鐘

1個(gè)循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘

45個(gè)循環(huán)：94 ℃，15秒

58℃，30秒  

步驟4. 啟動(dòng)程序

步驟5. 數(shù)據(jù)解讀

八、使用注意事項(xiàng)：

• 使用前應(yīng)認(rèn)真閱讀說明書。
• 來自不同批次的試劑不能混合。
• 試劑盒內(nèi)的試劑應(yīng)始終作為一個(gè)整體溶解分裝。
• 試劑盒應(yīng)在效期內(nèi)使用。
• 每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陽性對(duì)照。每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照和/或一個(gè)無模板對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對(duì)照。對(duì)照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗(yàn)室提供的對(duì)照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對(duì)照，對(duì)于確認(rèn)結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
• 建議在無RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR，以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號(hào)15-2025，預(yù)先清潔實(shí)驗(yàn)環(huán)境。）
• 盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù)，同時(shí)避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。（RNA降解會(huì)極da地限制了RT-qPCR反應(yīng)的性能）。請(qǐng)確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。
• 樣本制備過程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會(huì)降低qPCR的準(zhǔn)確性。

九、參考文獻(xiàn)

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.