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細胞培養(yǎng)用液的配制與消毒

更新時間:2022-01-25  |  點擊率:1756

器材與試劑:干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶,青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟:

(一)水的制備

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

(二)PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制)

1.溶解定容:將藥品(NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4-H2O 1.56 g,KH2PO4 0. 2 g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中,玻璃棒攪動,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000 ml,搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒:將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi),蓋上膠帽,并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。

(三)胰蛋白酶溶液的配制與消毒

胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān),在pH為8.0、溫度為37℃時,胰酶溶液的作用能力很強。使用胰酶時,應(yīng)把握好濃度、溫度和時間,以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。終止消化時,可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

1.稱取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液濃度為0.25%,用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻,置于4℃內(nèi)過夜。

2.用注射濾器抽濾消毒:配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

(四)青、鏈霉素溶液的配制于消毒

1.所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶,用注射器加4 ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶,加5 ml滅菌雙蒸水,即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養(yǎng)液中,使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位=1微克

(五)RPMI1640的制備與消毒

1.溶解、調(diào)PH值、定容:先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品。然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5 ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000 ml,搖勻。

2.安裝蔡式濾器:安裝時先裝好支架,按規(guī)定放好濾膜,用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾:配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。

4.分裝:將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100 ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃時兩周有效)。

(六)血清的滅活

細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清,新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后,再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

(七)HEPES溶液

HEPES的化學(xué)全稱位羥yi基呱嗪乙硫磺酸(N’
-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑,能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50 mmol/L,一般培養(yǎng)液內(nèi)含20 mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

1 mol/L HEPE緩沖液配制方法如下:準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g,加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌,分裝后4℃保存。注意:因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶,所以可根據(jù)實際情況靈活配制,但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20 mmol/L 。如:稱取4.766克HEPES溶于20 ml三蒸水中,過濾除菌后可*(20 ml)加入1 L培養(yǎng)液中,或者每100 ml培養(yǎng)液中加入2 ml即可。

(八)谷氨酰胺

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,4℃下放置1周可分解50%,故應(yīng)單獨配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時,應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1~4 mmol/L??梢耘渲?00 mmol/L谷氨酰胺液貯存,用時加入培養(yǎng)液。配制方法為,谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100 ml即配成200 mmol/L的溶液,充分攪拌溶解后,過濾除菌,分裝小瓶,-20℃保存,使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1 ml谷氨酰胺溶液。

(九)肝素溶液的配制

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高,肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉,包裝為約為0.56克/瓶,配制時,可將其溶于100ml三蒸水中,定容,過夜,然后過濾除菌,分裝小瓶,保存溫度為℃。使用時,向100ml培養(yǎng)液中加入1ml(精確可加入0.9ml)即可。

(十)Ⅰ型膠原酶

0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意:因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大,不容易過濾,因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

(十一)明膠溶液

因為明膠難于過濾,所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克(配成100ml溶液)-即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1的溶液,明膠也難溶,因此要充分搖勻,過夜放置,然后無菌分裝入50ml小瓶中, 4℃保存。

(十二)其他培養(yǎng)用液的配制:

20ug/ml內(nèi)皮生長因子

注意事項:

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張,放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方,并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2,可在配制時調(diào)PH至7.4。

在細胞培養(yǎng)過程中,支原體感染發(fā)生率達到63%,因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。細胞培養(yǎng)中常遇見的有細菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說起支原體污染,估計細胞培養(yǎng)的同學(xué)就開始犯愁了,細胞培養(yǎng)的老手都知道,支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后,如果不進行有效*的支原體清除,該實驗的細胞培養(yǎng)很難進行下去,細胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑,無法進行正常實驗,有的實驗室甚至只能指望換細胞間。那么怎樣才能有效檢測并清除支原體污染呢?

有沒有什么方法能夠簡單高效地祛除DNA污染呢?

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當(dāng)然有:Minerva Biolabs PCR Clean™

通過中和以及降解的原理,可快速有效地祛除任何物體表面的DNA、RNA以及DNA酶、RNA酶的污染,使它們快速的降解,從而確保PCR實驗結(jié)果的準(zhǔn)確。

使用方法也十分簡單:

將PCR Clean™噴在操作臺表面,反應(yīng)1分鐘后,即可用干凈紙巾擦干試劑。

注:如果沒有擦拭干凈,液體揮發(fā)后表面可能有白色殘留,影響美觀。此時可用噴壺噴灑蒸餾水到白色殘留處,然后擦拭即可。

針對移液器需要去除DNA污染,可按照說明書拆開移液器,將桿軸浸泡在PCR Clean™噴霧劑中,1分鐘后取出后用水沖洗,晾干,重新組合。

 

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