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腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)

更新時(shí)間:2022-04-20  |  點(diǎn)擊率:540

原理

腫瘤組織及細(xì)胞在模擬體內(nèi)生長環(huán)境的條件下、與一般組織細(xì)胞一樣、也能夠生長發(fā)育乃至繁殖、為研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、腫瘤分子生物學(xué)提供大量的實(shí)驗(yàn)材料。

材料與儀器

腫瘤組織
培養(yǎng)液 Hanks 胰蛋白酶 EDTA 膠原酶
培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)皿 吸管和膠帽 眼科剪 眼科鑷 二氧化碳培養(yǎng)箱 超凈工作臺(tái)

步驟

一、取材


人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要,體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),取材時(shí)盡量避免用退變組織,要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng),如因故不能立即培養(yǎng),可貯存于4 ℃中,但不宜超過24 小時(shí)。


二、培養(yǎng)基


腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格,一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低,正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長,腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大,是因腫瘤細(xì)胞有自泌(Autocrine)性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤組織*不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子;腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子,有的還需特異性生長因子(如乳腺癌細(xì)胞等)??傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。


三、成纖維細(xì)胞的排除


成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長,致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快,最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法。


(1)刮除法:鏡下觀察腫瘤細(xì)胞,并在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部做下標(biāo)記,再用無菌膠刮刮除無標(biāo)記區(qū)域。

(2)反復(fù)貼壁法:腫瘤細(xì)胞貼壁速度比成纖維細(xì)胞慢,把含有兩類細(xì)胞的懸液反復(fù)貼壁,則成纖維細(xì)胞先貼壁而腫瘤細(xì)胞后貼壁,來達(dá)到分離兩類細(xì)胞的目的。


取A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶,先于A中接種入兩種細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基懸液,5~20min后輕輕將上清液吸出,接種至B,A中加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)B中細(xì)胞5~20min后,同樣方法將上清接種至C,再于C中加入*培養(yǎng)基。次觀察三瓶細(xì)胞,會(huì)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞A>B>C,C瓶中主要為腫瘤細(xì)胞,如需純化,可反復(fù)處理。

(3)酶消化法:成纖維細(xì)胞對(duì)酶更為敏感,故加入胰酶或膠原酶消化的時(shí)候比腫瘤細(xì)胞更易于脫落??捎阽R下觀察消化,待成纖維細(xì)胞脫落即刻終止消化,反復(fù)處理幾次可得較純的腫瘤細(xì)胞。

(4)復(fù)蘇、傳代和凍存同前。


注意事項(xiàng)

1. 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)也應(yīng)該遵循無菌操作的原則。


2. 腫瘤細(xì)胞在體外不容易培養(yǎng)形成穩(wěn)定的細(xì)胞系,故欲獲得好的培養(yǎng)效果應(yīng)采取一些特別的措施,如加入某種特殊的底物,或者加入促細(xì)胞生長因子,甚至需要先用動(dòng)物轉(zhuǎn)嫁接種成瘤以獲得更好的活性。


3. 因?yàn)槟承┠[瘤是病毒感染導(dǎo)致,所以腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意自我防護(hù)。

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