細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法對比，以及各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)，我們都已介紹過了。

今天來到細(xì)胞轉(zhuǎn)染——技巧篇，談?wù)勅绾尾拍苓M(jìn)行高效地轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染試劑的選擇

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。

每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。

細(xì)胞狀態(tài)

一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。

因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。

轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)根據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法進(jìn)行，但也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
（1）細(xì)胞培養(yǎng)物

推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。

（2）細(xì)胞密度
細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。

（3）血清
對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率。

不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。

胎牛血清經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長，因此也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。

（4）氮磷（N/P）比
N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達(dá)到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。
（5）DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。應(yīng)盡可能提高DNA的純度。

載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

病毒載體對特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。

除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。

血清在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要性不言而喻：

• 提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

• 提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

• 有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

• 是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。

• 起酸堿度緩沖液作用。

• 提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

• 參與細(xì)胞凍存。

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